全息拉曼显微镜:3D活细胞追踪、防伪统统搞定!

SEPTEMBER 2020


由于克服了传统拉曼光谱与生俱来的信号微弱的缺点,表面增强拉曼光谱(SERS)技术迅速发展成为一种快速、可靠的超灵敏检测手段,可以对各种复杂样品中的分子系统进行可靠而精确的鉴定。被广泛地应用于药品监管、食品安全检测和生物细胞分析等重要领域。然而,SERS仍然存在许多缺陷,其中最为突出的是其成像速率较慢。阻止了SERS在亚细胞水平上对活细胞的3D研究以及防伪等技术领域的应用。




西班牙巴塞罗那科学技术研究所Matz LiebelNiek F.van Hulst和维尔吉利大学塔拉戈纳公立大学Ramon A. Alvarez-Puebla等人将“SERS纳米粒子的工程设计”和“全息成像技术”相结合,“双管齐下”,提出了一种新颖的成像方式----全息拉曼显微镜


通过将迈克尔逊干涉仪与基于剪切干涉仪的全息显微镜耦合,研究人员同时记录了多个SERS纳米颗粒及其各自的拉曼光谱的宽视场图像的相位和幅度。此外,该工作使数字图像传播不仅能够实现对单个图像不同z位置的多个SERS纳米粒子进行3D定位,而且能够实现在三个维度上定位和跟踪活细胞内的单个SERS纳米粒子。


研究人员将小型纳米粒子组装成等离激元纳米粒子超团簇,从而在受限的团簇尺寸内产生非常强的电场。从而提高空间分辨率,减少对细胞活力的负面影响。研究人员合成了由各种不同的SERS活性分子编码且高度均匀的16 nm金纳米粒子,然后将它们组装成约100nm的纳米粒子超团簇(图1b)。 这些超团簇的特征是局部表面等离子体共振。与初始粒子相比,增强因子为2×106 这些具有不同SERS代码的纳米颗粒的明亮而坚固的超团簇是用于快速多路成像的理想系统,具有可再现性,易于制备,胶体稳定性和直接表面功能化的优点。


1:用于自发拉曼全息成像的明亮SERS超级簇。(a) 局部热点和分子与SERS底物之间的强相互作用产生增强的拉曼信号; (b) SERS编码的金超团簇粒子的TEM; (c)由迈克尔逊和剪切干涉仪组成的光谱分辨全息宽视场显微镜示意图,可同时进行光谱分辨成像和图像相位测量。 


研究人员选择了数字全息成像技术,因为它不仅是体积成像的理想选择,而且是可以从大3D体积中的单个图像对数百个单粒子进行跟踪。然而,由于需要信号场与参考场之间的干涉来恢复重要的相位信息,全息技术十分依赖于相干光。研究人员组装了由迈克尔逊和剪切干涉仪组成的光谱分辨全息宽视场显微镜(图1c),可同时进行光谱分辨成像和图像相位测量。这也证实了自发拉曼信号的全息成像的可能。


此外,研究人员还演示了初步的3D全息活细胞跟踪实验(图2)。首先,研究人员将掺入SERS的超团簇在HeLa活细胞中于37°C孵育3 h,然后获取延时SERS以及明场图像以捕获SERS粒子和细胞的运动。根据获得的代表性10分钟活细胞SERS粒子跟踪视频,研究人员发现,连续采集明场图像和SERS图像之间的间隔为500µms。为了获得单个SERS探针的3D轨迹,研究人员依靠上面介绍的传播内核执行基于拉曼全息术的3D单粒子定位。使用SERS信号的全息测得的幅度和相位信息,以50µnm的步长传播,在±3µm的总z范围内生成3D图像堆栈。一旦获得了图像堆栈,即可通过结合高斯拟合和最大幅度估计来确定所有粒子的精确3D位置,然后将各个粒子的位置链接起来,以生成图6中所示的3D轨迹,该轨迹显示了受限3D扩散与活细胞内有效3D传输周期的组合。

2:活细胞SERS粒子跟踪

研究证明,观察到的发射确实是由于拉曼散射而不是背景发光或不良滤光片选择的结果。用于细胞内感测的最先进的拉曼传感器主要依赖于两个不同的拉曼谱带的比率,并且可以通过光谱操纵由2D光栅产生的四个衍射级中的一些来实现对这些谱带的同时测量。此外,这样的策略可以允许同时对多达六个拉曼波段进行成像,以实现更加精细的多路复用安排,从而可以实时地对生命系统进行复杂的化学定量。重要的是,即使多重实验允许直接访问高度复杂的现象,合理设计依赖于系统的SERS探针也很重要,以避免感兴趣的标记带被强的但与实验无关的拉曼跃迁的散粒噪声所掩盖。目前研究人员正在开发用于活细胞内部化学感应(以及用于防伪应用的复杂代码的生成)的单次拉曼全息照相的光谱多路复用实现,并将最终实现具有化学敏感性的细胞活动的精确3D映射。这些观察结果既可以检测早期感染,也可以发现新的基于细胞的疗法来对抗复发性恶性肿瘤,例如癌症。此外,超级簇和SERS全息技术相结合所提供的多功能性和速度使得能够生成(并快速获取)复杂的图案,能够以复杂的3D模式编码光谱信息,从而在防伪货币文件和商业标签等领域具有极大的技术适用性。